Estructuras de núcleo y varilla de una luz de cianobacteria termófila

Nature Communications volumen 13, Número de artículo: 3389 (2022) Citar este artículo

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Las cianobacterias, las glaucofitas y las rodófitas utilizan ficobilisomas gigantes captadores de luz (PBS) para capturar la energía solar y transportarla a los centros de reacción fotosintética. Los PBS son composicional y estructuralmente diversos y extremadamente complejos, todo lo cual plantea un desafío para una comprensión integral de su función. Hasta la fecha, se han descrito tres arquitecturas detalladas de PBS por microscopía crioelectrónica (crio-EM): un tipo hemielipsoidal, un tipo de bloque de rodofitas y un tipo hemidiscoidal de cianobacterias. Aquí, informamos estructuras crio-EM de un núcleo de aloficocianina pentacilíndrico y una varilla que contiene ficocianina de un PBS hemidiscoide cianobacteriano termófilo. Las estructuras definen la disposición espacial de las subunidades de proteínas y los cromóforos, cruciales para descifrar el mecanismo de transferencia de energía. Revelan cómo se forma el núcleo pentacilíndrico, identifican interacciones clave entre las proteínas conectoras y los cromóforos de bilina e indican vías para la transferencia de energía unidireccional.

Las cianobacterias, glaucófitas y rodófitas utilizan un gran complejo captador de luz soluble en agua llamado ficobilisoma (PBS) para la absorción de energía solar y la transferencia de energía a las proteínas de la membrana fotosintética (fotosistema I y fotosistema II; PSI y PSII)1. Los PBS absorben principalmente luz visible a 490–650 nm, que PSI y PSII tienen dificultades para absorber (como excepción, las cianobacterias que contienen clorofila albergan PBS que absorben luz infrarroja cercana2,3) (Figura 1 complementaria). El PBS está compuesto de ficobiliproteínas (PBP) como la ficoeritrina, la ficoeritrocianina, la ficocianina (PC) y la aloficocianina (APC). Las unidades de ensamblaje de las PBP son subunidades α y β que tienen pliegues de globina y albergan varios cromóforos de tetrapirrol lineales, como ficoeritrobilina, ficourobilina, ficoviolobilina y ficocianobilina (PCB)4. Los oligómeros de estas subunidades α y β interactúan con proteínas conectoras no cromoforiladas para formar bastones de PC en todo el complejo PBS. Se han informado cinco tipos de morfología estructural de PBS: hemidiscoidal5,6,7, hemielipsoidal8, block-type9, rod-type10,11,12,13 y bundle-type14. Los PBS hemidiscoidales tienen núcleos bicilíndricos15,16, tricilíndricos5 o pentacilíndricos3,17. La composición de las PBP con respecto al número de bastones, la estructura general de las PBS y su asociación con PSI y PSII están reguladas por la disponibilidad de luz y nutrientes11,18. Recientemente, las estructuras tridimensionales (3D) de tres tipos de PBS se analizaron mediante microscopía crioelectrónica (cryo-EM)19,20,21,22 y se revelaron detalles de sus núcleos tricilíndricos y pentacilíndricos y vías de transferencia de energía. Debido a que los PBS son de composición y estructura diversa y extremadamente complejos, los análisis estructurales y funcionales de los PBS en diferentes especies son esenciales para la comprensión integral de sus mecanismos de trabajo. Además, estas estructuras proporcionan una base para comprender varios PBS de cianobacterias y pueden utilizarse para promover el uso eficiente de la energía solar23,24,25.

Aquí, informamos las estructuras del núcleo APC pentacilíndrico y la varilla PC de la cianobacteria termófila Thermosynechococcus vulcanus con resoluciones de 3,7 Å y 4,2 Å, respectivamente. Aunque sus estructuras generales eran extremadamente similares a la estructura PBS de Anabaena sp. PCC 7120 (en lo sucesivo denominado Nostoc 7120) notificado por la ref. 22, observamos las diferencias en sus estructuras internas. Las estructuras revelaron diferencias en el PBS hemidiscoidal de diferentes especies y proporcionan un posible mecanismo para la transferencia de energía de excitación unidireccional.

El PBS de T. vulcanus NIES-2134 (en lo sucesivo denominado T. vulcanus) tiene una estructura hemidiscoidal con un núcleo APC pentacilíndrico y seis varillas de PC, con un peso molecular total de ~6 MDa22,26 (Fig. 2 complementaria). El núcleo y los bastones comprenden subunidades α- (CpcA, ApcA, ApcD y ApcE) y β- (CpcB, ApcB y ApcF), y su unidad constituyente básica es un monómero αβ27. Los PCB se unen covalentemente a residuos de cisteína conservados en las subunidades α y β a través de enlaces tioéter28. Se cree que las proteínas conectoras en el PBS contribuyen no solo a la estabilidad estructural del PBS sino también al ajuste del nivel de energía de los cromóforos29. Las proteínas enlazadoras de T. vulcanus se clasifican como enlazadoras de varillas (LR; CpcC); enlazador de terminal de barra (LRT; CpcD); enlazadores de núcleo de barra (LRC; CpcG1, CpcG2 y CpcG4); enlazadores de núcleo-membrana (LCM; ApcE), que se unen a los trímeros APC de los cilindros de núcleo de PBS; o enlazadores de núcleo (LC; ApcC), que se unen al núcleo de PBS. Cuando el PBS absorbe luz, la energía de excitación se transfiere rápidamente (del orden de picosegundos) a cromóforos en subunidades en la superficie de la membrana llamados emisores terminales (ApcE [LCM] y ApcD) y luego finalmente a PSII y PSI30. Se han informado varias estructuras cristalinas de rayos X de PC y APC de T. vulcanus, que han proporcionado puntos de partida para discusiones sobre posibles configuraciones estructurales generales y mecanismos de transferencia de energía interna en PBS31,32,33,34,35,36, 37.

El núcleo de APC pentacilíndrico (núcleo de PBS) y la barra de PC se obtuvieron a partir de preparaciones de PBS, seguidos de un tratamiento de fijación en gradiente (GraFix)26,38 y un tratamiento con tampón de fosfato de baja concentración, respectivamente. Para las imágenes crio-EM, es preferible eliminar los estabilizadores altamente concentrados (en este caso, el estabilizador era un tampón de fosfato); sin embargo, esto promueve la disociación de las varillas de PC del núcleo de PBS tanto en algas rojas como en cianobacterias, incluida T. vulcanus. Aunque las varillas de PC se unieron al núcleo de PBS en el PBS preparado, la mayoría de las varillas de PC se disociaron durante el tratamiento con GraFix (Fig. 2 complementaria). Los promedios bidimensionales (2D) con EM de tinción negativa mostraron que el cilindro en la parte inferior del PBS de T. vulcanus preparado comprende tres trímeros de APC. Según lo informado por la ref. 22, las varillas de PC en PBS de cianobacterias son considerablemente menos interactivas que las de las algas rojas19, y el tratamiento de reticulación con glutaraldehído para evitar la disociación de las varillas de PC ayudó a mantener la estructura del núcleo de PBS. Sin embargo, algunas de las barras de PC se disociaron del núcleo de PBS. La razón de la interacción más débil de las varillas de PC en PBS de cianobacterias en comparación con PBS de algas rojas probablemente se deba a las diferencias en la morfología de PBS. En los PBS de algas rojas (tipos bloque y hemielipsoidal), hay muchos bastones de ficoeritrina (PE) densamente empaquetados, lo que sugiere la posibilidad de numerosas interacciones entre los bastones. Sin embargo, las varillas de PC de PBS de cianobacterias (tipo hemidiscoidal) están dispuestas en forma de abanico, lo que indica que hay menos interacciones entre las varillas de PC que entre las varillas de PE de las PBS de algas rojas. La diferencia en la morfología sugiere que el PBS de cianobacterias es más propenso a la disociación de los bastones de PC que el PBS de algas rojas en condiciones de tampón de fosfato de baja concentración.

Los mapas crio-EM del núcleo de PBS y la varilla de PC se reconstruyeron a resoluciones de 3,7 Å y 4,2 Å, respectivamente, en función de los criterios de correlación de capa de Fourier estándar de oro [FSC] de 0,143 entre dos medios mapas (Tabla complementaria 1). Los modelos estructurales fueron refinados contra los mapas, que validaron las resoluciones; un valor FSC de 0,5 entre el modelo y el mapa: 3,8 Å (núcleo de PBS) y 4,2 Å (varilla de PC); Estimaciones basadas en Q-score39: 3,6 Å (Q = 0,49; núcleo de PBS) y 4,0 Å (Q = 0,40; varilla de PC) (Figuras complementarias 3 y 4 y Tablas complementarias 1–3).

El núcleo de PBS analizado de T. vulcanus muestra una estructura hemidiscoidal con simetría C2, compuesta por tres cilindros (A, A' y B), dos cilindros (C y C') con algunas varillas de PC que interactúan con el núcleo de PBS (Fig. 1). La estructura general del núcleo de PBS era muy similar a la de Nostoc 71207,22. La simetría doble estricta no se mantuvo en la parte exterior de las barras de PC (Rb, Rb', Rt, Rt', Rs1, Rs1', Rs2 y Rs2')7, ya que muchas de estas partes probablemente se disociaron del núcleo durante preparación de la muestra (ver arriba). El mapa crio-EM resuelve partes de las varillas, pero la resolución local de las regiones correspondientes varía de 7 Å a 20 Å (Fig. 3 complementaria). Por lo tanto, no construimos modelos de las varillas (Fig. 1c). El núcleo de PBS es un supercomplejo con las dimensiones 110 × 210 × 300 Å y está compuesto por 38 ApcA, 40 ApcB, 6 ApcC, 2 ApcD, 2 ApcE (LCM), 2 ApcF y 84 PCB (Fig. 5 complementaria, Complementaria). Tabla 4). En el otro núcleo de PBS de cianobacterias22, los cilindros A y B constan cada uno de cuatro trímeros de APC, mientras que el núcleo de PBS de T. vulcanus comprende tres trímeros de APC en el cilindro A y cuatro trímeros de APC en el cilindro B. ApcD ha sido identificado en el cuarto trímero APC del cilindro A de los otros PBS cianobacterianos, y este trímero juega un papel importante en la transferencia de energía desde el PBS a las proteínas de la membrana fotosintética22. Se considera que si el arreglo de ApcD es el mismo en los PBSs de la cianobacteria Synechococcus sp. PCC 7002 (en lo sucesivo, Synechococcus 7002), Nostoc 7120 y T. vulcanus, luego T. vulcanus PBS debe tener un cuarto trímero APC en el cilindro A. Sin embargo, el PBS preparado de T. vulcanus contiene ApcD, y los promedios 2D con EM de tinción negativa confirmaron que el cilindro A constaba de tres trímeros APC (Fig. 2a, c, d complementarias). Esto sugiere que la disposición de ApcD en T. vulcanus PBS difiere de la de PBS en otras especies. En la actualidad, no entendemos claramente por qué T. vulcanus tiene tres trímeros APC en el cilindro A en lugar de cuatro.

Mapa crio-EM del núcleo de PBS desde las vistas frontal (a, c), lateral (b, e, f) e inferior (d). c Muestra la superposición del mapa crio-EM y el modelo central refinado de PBS. e Aquí se muestra la estructura dentro del rectángulo en a, ampliada y girada 90˚. f Esto muestra e girado 180˚. g Modelo esquemático del núcleo APC pentacilíndrico (incluidos los cilindros A (A'), B y C (C')) y varillas PC (Rb, Rb', Rt y Rt'). ApcE (LCM) que contiene α, Reps 1–4 y Arms 1–3 se muestra en rojo. Las varillas de PC que no construyeron el modelo se muestran en translúcido. Los modelos de varillas de PC se dibujaron haciendo referencia al mapa crio-EM en este estudio y la estructura PBS de Nostoc 71207. h Modelo esquemático de la varilla de PC. CpcC (LR), CpcD (LRT) y CpcG (LRC) interactúan dentro de los dos hexámeros PC. La identificación de ApcD es tentativa. ApcD se muestra entre paréntesis (ApcD).

El cilindro A está compuesto por las subunidades α de las ficobiliproteínas (ApcA, ApcD y ApcE [LCM]), las subunidades β de las ficobiliproteínas (ApcB y ApcF) y ApcC (Lc). El cilindro A (A') consta de tres trímeros APC (A1, A2 y A3) con subunidades de ApcD/ApcB y dos ApcA/ApcB (A1); tres ApcA/ApcB (A2); y ApcE/ApcB, ApcA/ApcF y ApcA/ApcB (A3), respectivamente (Fig. 2a). El análisis electroforético muestra que ApcD está presente en PBS preparados (Fig. 2c complementaria) 26, pero ApcD no pudo identificarse en el mapa crio-EM debido a la resolución limitada. Luego asignamos tentativamente ApcD a una subunidad que no pudo identificarse como ApcA en este estudio (sin embargo, identificamos ApcA en lugar de ApcD en el modelo estructural [código PDB: 7VEA]) (Fig. 6 complementaria). El cilindro B consta de cuatro trímeros APC que consisten en ApcA y ApcB (B1, B2, B1' y B2'). Además, LC interactúa con un lado de los cilindros A y C, mientras que interactúa con ambos lados del cilindro B. El cilindro C consta de dos trímeros APC, ApcA y ApcB, que corresponden a un medio cilindro B.

ApcE (LCM) es un emisor terminal que se encuentra en la superficie de la membrana en el cilindro A y transfiere energía a PSII. ApcE (LCM) consiste en αLCM, y uno de sus dominios exhibe una estructura similar a ApcA, cuatro motivos repetidos llamados "repeticiones" (Rep1–Rep4) y "brazos" (Arm1–3) que conectan los motivos. Rep1 interactúa con ApcF, dos ApcAs (α2 y α3) y una ApcB (β1) en A1 (Fig. 2b). Aunque los ApcE (LCM) de los dos PBS de algas rojas y Synechococcus 7002 PBS no contienen Rep4, las desviaciones cuadráticas medias (RMSD) de Rep1–Rep4 en los ApcE (LCM) de cada especie son pequeñas, y la secuencia la identidad de Rep1–Rep4 de las cianobacterias tiende a ser alta (Tabla complementaria 5). Esto sugiere que la estructura y función de cada Rep es similar, a pesar de la diferencia en especies.

a Disposición de los emisores terminales (αLCM de ApcE [LCM] y ApcD), ApcF y proteínas enlazadoras (ApcE [LCM] y ApcCs). b Estructuras del trímero APC (A3) y Rep1 de ApcE (LCM) en el cilindro A. c Estructuras de los trímeros A1 y A2 de APC, ApcC y Rep2 de ApcE (LCM) en el cilindro A. d Estructuras de los trímeros APC B1 y B2, ApcC, Rep3 y Arm3 de ApcE (LCM) en el cilindro B. e Estructura de los trímeros APC C1 y C2, ApcC y Rep4 de ApcE (LCM) en el cilindro C'. f Superposición de cuatro estructuras Rep (Reps1–4). Las líneas discontinuas indican las hélices α en las regiones Rep. Rep1, verde; Rep2, rojo; Rep3, azul; Rep4, cian.

En las estructuras de algas rojas reportadas recientemente, ApcC interactúa con Rep1 de ApcE (LCM), mientras que ApcC y (ApcD) podrían interactuar con Rep2 del núcleo PBS de T. vulcanus, lo que sugiere que la interacción entre las subunidades en el núcleo también difiere entre especies. Rep3 de ApcE (LCM), junto con ApcC, contribuyen al mantenimiento de la estructura y función de los dos trímeros APC en el cilindro B. Arm3 se extiende a Rep4, que sirve como dominio enlazador del cilindro C. Rep4 interactúa con ApcC de la misma manera que Rep2 y Rep3, lo que significa que cada cilindro en el núcleo de PBS contiene un ApcC (Fig. 2c-e). Una característica interesante de Reps1-4 en ApcE (LCM) es que las estructuras de las regiones de hélice α son similares, mientras que las estructuras de las regiones de bucle difieren (Fig. 2f). La identidad de secuencia entre los representantes no es alta (Fig. 7 complementaria), lo que sugiere no solo que los representantes 1–4 mantienen la estructura de cada cilindro, sino también que los distintos residuos de aminoácidos en cada representante alrededor de PCB podrían contribuir a la transferencia eficiente de la energía luminosa absorbida a los emisores terminales. Arm3, Rep4 de ApcE (LCM) y el cilindro C no están presentes en el núcleo de PBS de las algas rojas19,20 o Synechocystis6, mientras que estos componentes están presentes en aproximadamente la mitad de las cianobacterias si los dominios ApcE (LCM) se asignan al filogenético. árbol de las principales especies de cianobacterias (Figuras complementarias 8 y 9). Por lo tanto, común a muchas especies de algas, incluidas las cianobacterias, el cilindro C, Rep4 y Arm3, que mantienen el cilindro C en sí, deben desempeñar un papel clave en la captación de luz. ApcE (LCM) es una de las proteínas conectoras más importantes para la transferencia de energía a PSII1. La estructura de T. vulcanus PBS descrita en este estudio proporciona un punto de partida para comprender la arquitectura de los componentes y las redes organizativas para los mecanismos generales de trabajo de los PBS en el amplio grupo de algas.

La falta del "cuarto trímero APC" en el cilindro A de T. vulcanus PBS puede atribuirse al hecho de que ApcC que interactúa en el trímero APC no puede interactuar con Rep1 en ApcE. Hay dos tipos principales de conformación (Tipo I y II) en ApcC del PBS presente en Nostoc 7120 y Synechococcus 7002. ApcC que interactúa con Reps2–4 es de tipo I, mientras que ApcC que interactúa con Rep1 es de Tipo II (Fig. 10). Las estructuras de ApcC (Tipos I y II) de Nostoc 7120 y Synechococcus 7002 son similares (RMSD: 0,78 [Tipo I] y 0,74 [Tipo II]). Por el contrario, en T. vulcanus PBS, ApcC que interactúa con Reps3–4 es de Tipo I, pero ApcC que interactúa con Rep2 no es de Tipo I ni II (es decir, Tipo III). La comparación de los Tipos II y III reveló una disposición diferente de las regiones del bucle en ApcC (residuos 9–26, Fig. 10c complementaria) y un RMSD ligeramente más grande entre los Tipos I y III (1.7). Aunque las secuencias de aminoácidos de Reps1–4 y ApcC son similares en las tres cianobacterias (Fig. 10d complementaria), el entorno alrededor de Rep2 en T. vulcanus PBS puede alterar la interacción de ApcC en comparación con la de las otras cianobacterias. Esto sugiere que el entorno que rodea a Rep1 en T. vulcanus PBS no permite la interacción de ApcC y, por lo tanto, el "cuarto trímero de APC" no puede interactuar con Rep1.

La energía de excitación se transfiere a los emisores terminales (ApcE [LCM] y ApcD) a través de cromóforos en los cilindros B y C (C'), y la energía finalmente se transfiere a PSII y PSI. T. vulcanus tiene PCB como su único cromóforo, y es el entorno proteico alrededor de cada cromóforo el que debe estar íntimamente involucrado en la transferencia de la energía excitada a los emisores terminales. De hecho, los residuos de aminoácidos con grupos polares/cargados afectan la energía de absorción de los pigmentos40.

La figura 3 muestra cada cilindro que constituye el núcleo de PBS, los cromóforos en el núcleo y las distancias entre los cromóforos. En general, la energía de excitación se transfiere entre pares cercanos de cromóforos, es decir, el donante (D) y el aceptor (A) (Transferencia de energía de resonancia de Förster; FRET)41,42. Sin embargo, la transferencia de energía entre los cromóforos en el PBS no puede explicarse solo por el mecanismo FRET, porque se han observado señales de coherencia fotoexcitadas que indican acoplamiento exitónico tanto en PC como en APC43,44. Además, experimentos recientes revelaron una nueva característica, en la que las excitaciones se comparten coherentemente entre las moléculas donadoras y aceptoras durante la transferencia de energía45. Además, estudios previos sugieren que puede ocurrir algún tipo de acoplamiento excitónico, incluso a una distancia que oscila entre 20 Å y 30 Å, lo que permite que el PBS transfiera energía con altas eficiencias29,46. MacColl46 informó un acoplamiento excitónico entre los dos cromóforos del trímero APC ubicados en proximidad a través de la interfaz monómero-monómero, y esta fuerte interacción induce al excitón a un desplazamiento hacia el rojo en el espectro de absorción. Aunque la evidencia respalda ambos mecanismos, la fluorescencia ultrarrápida resultante de una serie de enfoques ahora indica que el mecanismo de acoplamiento excitónico es más plausible; sin embargo, aunque el modelo estructural obtenido en este estudio permite una interpretación de la disposición y orientación de los cromóforos en el PBS y sus interacciones circundantes (especialmente con las proteínas conectoras), el modelo estructural por sí solo no permite una interpretación completa del acoplamiento excitónico entre cromóforos vecinos. La proteína enlazadora no solo estabiliza la estructura de PBS, sino que también altera las propiedades de absorción/emisión del cromóforo e incluso puede crear el entorno necesario para la unión de excitones entre los cromóforos29. En este estudio, proponemos la ruta de transferencia de energía basada en la distancia entre los cromóforos y su orientación en los cromóforos que interactúan con las proteínas enlazadoras.

a Posibles vías de transferencia de energía en y entre los cilindros B y C (C'). b Posibles rutas de transferencia de energía en y entre los cilindros A y C. c Posibles vías de transferencia de energía entre los cilindros A (A') y B. d–g Los cromóforos y los residuos de aminoácidos circundantes de ApcE (LCM). Los números cerca de las líneas punteadas indican las distancias (Å) entre los pares de PCB. Por ejemplo, las líneas discontinuas (negra y verde) indican enlaces de hidrógeno y las líneas punteadas (azul) indican enlaces covalentes entre el PCB y el residuo de cisteína. En los residuos de aminoácidos (Phe992/ApcE y Cys84/C1) en d, las direcciones de los átomos de Cα a Cβ en los residuos se indican mediante objetos en forma de cápsula. La identificación de ApcD es tentativa y el cromóforo en ApcD (A1αApcD81) se indica entre paréntesis.

Hay cuatro factores principales asociados con la tasa de transferencia de energía de excitación por el mecanismo FRET: (i) la distancia entre D y A; (ii) el factor de orientación, κ2, que es un factor que describe la orientación relativa de los dipolos de transición de D y A en el espacio (Fig. 11 complementaria); (iii) la integral de superposición entre los espectros de fluorescencia y absorción de D y A, respectivamente; y (iv) rendimiento cuántico de D en ausencia de A. Para un pigmento D y A que giran libremente, κ2 tiene un valor medio de 2/3, y los valores de κ2 que representan los cromóforos significativos son aproximadamente 1–3 (Tabla complementaria 6, Figuras complementarias 11 y 12). Esto indica que es probable que se produzca una transferencia de energía entre sus cromóforos en el núcleo de PBS. La eficiencia es inversamente proporcional a la sexta potencia de la distancia entre D y A a través del acoplamiento dipolo-dipolo; por lo tanto, cuanto menor sea la distancia entre los cromóforos, mayor será la velocidad y la eficiencia de la transferencia de energía entre ellos. Por lo tanto, la eficiencia de la transferencia de energía entre cilindros también depende en gran medida de la distancia entre los cromóforos cercanos.

Los cromóforos en el núcleo de PBS están numerados de acuerdo con la nomenclatura de los del alga roja19,20, y sus nombres se definen de la siguiente manera: nombre del cilindro (A, B o C), tipo de subunidad (α o β) y el número del residuo de cisteína (84) al que está unido el cromóforo (Fig. 13 complementaria). Nuevamente, reiteramos que las estructuras de PBS de algas rojas descritas anteriormente no contienen cilindros C19,20. Los cromóforos involucrados en la transferencia de energía entre o dentro de cada cilindro se muestran en la Fig. 3a-c. La transferencia de energía del cilindro C (C') a los cilindros B y A (A') ocurre a través de C1α184–B1α284 (33 Å) y C2α384–A2α384 (35 Å), respectivamente (Fig. 3a, b). En la estructura actual, el anillo D de PCB en muchas ApcB forma interacciones π–π con residuos de tirosina (Y90), pero es probable que el anillo D de C1β384 interactúe con Phe992 dentro de la región del bucle (residuos 990–997) de Rep4 en ApcE. (Figura 3d). Además, C1β384 interactúa con S1122/ApcE. Estas interacciones probablemente contribuyen a la transferencia de energía del cilindro C (C') al cilindro B. En el PBS de cianobacterias con varillas de PC unidas (Rt, Rb, Rs1 y Rs2)7,22,26, se cree que la energía recibida por las varillas de PC se transfiere a los cilindros B y A (A') a través de la C ( cilindro C'), lo que indica que el cilindro C (C') actúa como intermediario para la transferencia de energía desde las varillas de PC a los emisores terminales.

El cilindro B consta de cuatro trímeros APC, con dos trímeros APC (B2 y B2') que interactúan entre sí. Esto indica que la transferencia de energía en el cilindro B está mediada por B2β284–B2'β184 (27 Å), B2β184–B2'β184 (29 Å) y B2β384–B2'β84 (27 Å) (Fig. 3a). La transferencia de energía del cilindro B al cilindro A (A') parece involucrar B1'α384–A1αApcD81 (33 Å) y B2α284–A3'α384 (34 Å) (Fig. 3c). Además, existe una interacción entre los cilindros A y A', lo que sugiere que la transferencia de energía se produce a través de A2α284–A3'α384 (32 Å). Estos cromóforos interactúan con Rep3 y Rep4 de ApcE, y las composiciones de residuos de aminoácidos de ApcE difieren alrededor de cada uno de los cuatro cromóforos (C1β384, B2β384, B2β284 y B2β184) (Fig. 3d-g). Tres cromóforos (B2β384, B2β284 y B2β184) interactúan con residuos de aminoácidos en Rep3/ApcE, alterando significativamente la estructura periférica de cada cromóforo. B2β384 forma enlaces de hidrógeno con residuos de asparagina (N809/ApcE y N835/ApcE), y los aminoácidos básicos (R761/ApcE y K890/ApcE) están presentes cerca de B2β284. B2β184 interactúa con un residuo básico (R730/ApcE) y está rodeado de aminoácidos hidrofóbicos (L873/ApcE, T872/ApcE y F878/ApcE). Esta diferencia en el entorno proteico alrededor de cada cromóforo puede definir su nivel de energía individual.

Se cree que tres PCB en el cilindro A (A2α384, A2α284 y A3α384) son los cromóforos clave que reciben energía de excitación de los cilindros B y C en función de su disposición espacial (Fig. 3b), que finalmente la pasan al cromóforo. (A3αLCM198) en los emisores terminales. En este caso, lo más probable es que la energía de excitación se transfiera a través de los cuatro cromóforos (A2α184, A2β384, A3β184 y A3β284) cerca de estos dos cromóforos. Tres de los cuatro cromóforos interactúan con Rep1 o Rep2, en una estructura característica (Fig. 4a-c). El valor de κ2 y la distancia entre los cromóforos también sugieren que la eficiencia de transferencia de energía de A3αLCM198–A3βApcF82 es la más alta entre todos los pares identificados (Tabla complementaria 6).

a, b Cromóforos en el trímero A3 de APC y su interacción con Rep1 de ApcE. c Cromóforo en el trímero A2 de APC y su interacción con Rep2 de ApcE. d Cromóforo de ApcF y su interacción con Rep1 de ApcE. e Cromóforo de ApcE y su interacción con ApcF. Las líneas discontinuas (negras) indican enlaces de hidrógeno. Las líneas punteadas (azul) indican enlaces covalentes entre PCB y residuos de cisteína. Los residuos de aminoácidos para los que no se puede mostrar con precisión la disposición de la cadena lateral se indican con objetos en forma de cápsula. Las direcciones de los átomos de Cα a Cβ en los residuos están indicadas por los objetos en forma de cápsula.

A3β184 interactúa con Y306/ApcE y está rodeado de aminoácidos aromáticos (Y428/ApcE y F432/ApcE). A3β284 interactúa con S348/ApcE y R366/ApcE, y F373/ApcE está cerca del anillo D de A3β284. Además, A2β384 interactúa con R630/ApcE y está rodeado por tres aminoácidos aromáticos (Y455/ApcE, Y610/ApcE y F637/ApcE), con F637/ApcE cerca del anillo D de A2β384. Se observó que, en la estructura de los PBS de algas rojas, los aminoácidos aromáticos son abundantes en la vecindad de los cromóforos y se propuso que regulan el estado energético de cada cromóforo para lograr una transferencia de energía unidireccional19,20. Los aminoácidos aromáticos en las proteínas conectoras de T. vulcanus PBS pueden funcionar de manera similar, lo que sugiere que el entorno proteico alrededor de los tres cromóforos está optimizado para una transferencia eficiente de energía de excitación a los dos cromóforos.

El cromóforo A3βApcF82 en ApcF se une a C82/ApcF así como a C416/ApcE e interactúa con cuatro residuos de aminoácidos (Y265/ApcE, R84/ApcF, R77/ApcF y R78/ApcF). Esta interacción puede ayudar a ajustar el nivel de energía de A3βApcF82 para formar la vía de transferencia de energía de A3βApcF82 a A3αLCM198. El entorno alrededor de A3βApcF82 en ApcF y A3αLCM198 en ApcE puede ser uno de los elementos críticos involucrados en la transferencia de la energía de excitación unidireccional a PSI y PSII. Soulier y Bryant informaron que las interacciones entre los PCB unidos a las subunidades α y β del monómero APC adyacente en el trímero APC son responsables del desplazamiento hacia el rojo en la absorción del cromóforo47. En el PBS de T. vulcanus, la distancia entre A3βApcF82 y A3αLCM198 es de 20 Å, lo que sugiere que los dos cromóforos podrían formar un acoplamiento excitónico que eventualmente transfiere energía de excitación a PSI y PSII. ApcD es un emisor terminal que transfiere energía a PSI48,49,50, y los hallazgos del presente estudio sugieren que A1αApcD81 forma un acoplamiento excitónico con el vecino A1β184 y transfiere energía de excitación a PSI.

No pudimos identificar las cadenas laterales de tres residuos de aminoácidos (W166/ApcE, D163/ApcE y K159/ApcE), ya que el mapa crio-EM alrededor de A3αLCM198 estaba algo desordenado (Fig. 4e y Fig. 3e complementaria) . Sin embargo, la estructura actual sugiere que A3αLCM198 en ApcE podría formar una interacción π–π con W166/AcpE, ya que el anillo D de PCB y los residuos de tirosina en ApcA comúnmente forman una interacción π–π. Este residuo de triptófano (Trp) se conserva en el ApcE de todas las especies enumeradas en la figura complementaria 9. Tang et al.51 analizaron la estructura cristalina (código PDB: 4XXI) de la región α en el ApcE de Nostoc 7120, informando que la interacción de este Trp con el cromóforo es un factor en el corrimiento hacia el rojo en la adsorción del cromóforo. Además, 4XXI es un homodímero, y Trp en un monómero forma una interacción π–π con el anillo D del cromóforo, mientras que Trp en otro monómero se coloca perpendicular al anillo D del cromóforo formando una interacción catión–π con el cercano Arg160 (Figura 5).

una estructura cristalina de Nostoc 7120 ApcE con una resolución de 2,2 Å. b Estructura crio-EM del alga roja P. purpureum ApcE con una resolución de 2,8 Å. c Estructura Cryo-EM del alga roja G. pacifica ApcE a una resolución de 3,5 Å. d Estructura crio-EM de la cianobacteria Synechococcus 7002 ApcE con una resolución de 3,5 Å. e Estructura crio-EM de la cianobacteria Nostoc ApcE con una resolución de 3,9 Å. f Estructura crio-EM de la cianobacteria T. vulcanus ApcE a una resolución de 3,7 Å. Estas estructuras ApcE se superpusieron con su mapa de densidad contorneado en 1σ (a), 3σ (b), 2σ (c), 5σ (d), 3σ (e) y 3σ (f). Los residuos de aminoácidos para los que no se puede mostrar con precisión la disposición de la cadena lateral se indican con objetos en forma de cápsula. Las direcciones de los átomos de Cα a Cβ en los residuos están indicadas por los objetos en forma de cápsula.

Para investigar si la interacción π–π también se forma en las estructuras de PBS resueltas por cryo-EM19,20,22, evaluamos la región α en el ApcE de las estructuras de PBS y encontramos que solo P. purpureum PBS exhibió interacciones claras π–π entre el anillo D del cromóforo y Trp154/ApcE, mientras que G. pacifica PBS se modeló para formar una interacción catiónica π entre el anillo D de los cromóforos y Arg152/ApcE. Esto se debe a la calidad de los mapas crio-EM obtenidos, ya que las interacciones π–π no pueden indicarse claramente en las estructuras de PBS, excepto en la de PBS de P. purpureum. Sin embargo, considerando que las interacciones π–π contribuyen al desplazamiento hacia el rojo de la absorción del cromóforo51, es muy probable que el anillo D del cromóforo y Trp formen interacciones π–π en todas las estructuras de PBS, lo que indica que esta característica probablemente sea importante para transferencia de energía de A3αLCM198 a PSII. Más detalles con respecto a A3αLCM198 y las interacciones clave con las estructuras circundantes requerirán una estructura de mayor resolución del PBS y/o una estructura supercompleja que interactúe con PBS y PSII. Además, los residuos de aminoácidos próximos a A3αLCM198 exhibieron ligeras diferencias entre especies (Fig. 5). En el PBS de T. vulcanus, el residuo de aminoácido correspondiente a Tyr79/ApcF fue Tyr (G. pacifica y P. purpureum), Leu (Nostoc 7120) y Phe (Synechococcus 7002) en cada especie. Este residuo está ubicado a una distancia del anillo cromóforo que hace que sea poco probable que forme una interacción π–π; sin embargo, puede afectar la propiedad de absorción del cromóforo porque los residuos de aminoácidos polares/cargados afectan la energía de absorción de los pigmentos40.

La barra de PC está formada por monómeros de PC que consisten en una subunidad α (CpcA) y una subunidad β (CpcB) para formar dos hexámeros de PC (Fig. 6a), dentro de los cuales interactúan las proteínas enlazadoras. CpcC, CpcD, CpcG1, CpcG2 y CpcG4 se identificaron como proteínas conectoras de la PC en T. vulcanus PBS (Fig. 2 complementaria)26, y podríamos asignar CpcC, CpcD y CpcG2 en el mapa crio-EM de la Varilla de PC (Fig. 6b, c). Como CpcG1, CpcG2 y CpcG4 muestran secuencias de aminoácidos similares (Fig. 14 complementaria), la asignación de CpcG2 en este estudio es tentativa. Como se observa, las varillas de PC se disocian del PBS preparado y, por lo tanto, el mapa crio-EM obtenido representa la reconstrucción 3D utilizando partículas combinadas con múltiples CpcG (CpcG1, CpcG2 y CpcG4). Durante el análisis de partículas individuales, la clasificación 3D se puede utilizar para clasificar partículas extrañas y heterogéneas; sin embargo, las estructuras generales de CpcG1, CpcG2 y CpcG4 son extremadamente similares, lo que hizo imposible clasificar partículas con cada CpcG a una resolución de 4,2 Å.

En el PBS Nostoc 7120, cuando se eliminaron tres genes que codifican CpcG (CpcG1, CpcG2 y CpcG4), las varillas de PC no pudieron unirse al núcleo de PBS7. Cuando se eliminó uno de los genes que codifican CpcG, las varillas de PC podrían interactuar con el núcleo de PBS pero no de la misma manera que el PBS de tipo salvaje. Esto sugiere que la composición de la proteína CpcG es diferente en cada PC rod7. El mapa crio-EM mostró las proteínas conectoras que se extienden desde las varillas de PC interactuando con el núcleo de PBS. Aunque la calidad del mapa crio-EM fue insuficiente para construir un modelo estructural, la alta identidad de las secuencias de aminoácidos sugiere que la disposición de las CpcG de T. vulcanus es similar a la de Nostoc 7120 (Fig. 15 complementaria)7, 22 La región C-terminal de la proteína CpcG en Rt (Rt') y Rb (Rb') interactúa principalmente con la región periférica del cilindro B y la región periférica del cilindro A (A'), respectivamente. La región C-terminal de CpcG interactúa débilmente con los cilindros del núcleo de PBS y también soporta una barra.

La interacción entre las PC y las proteínas conectoras en el bastón de PC es asimétrica (Fig. 6), que es inducida por las interacciones entre CpcC, CpcD y CpcG2 en el bastón. Para investigar cómo la barra de PC identificada por crio-EM en este estudio difiere de las estructuras de barras de PC descritas anteriormente, superpusimos la barra de PC resuelta por cristalografía de rayos X32. Superpusimos el esqueleto Cα del polipéptido en el monómero 1 de PC (que consta de Cadena A y Cadena B) a los correspondientes en T. vulcanus (3O2C) y Nostoc 7120 (7EYD). Luego, se estimaron los RMSD entre los otros monómeros de PC, mientras se mantenía la disposición completa de las barras de PC. Aunque no hubo diferencias importantes en la estructura de cada monómero de PC que comprende las varillas de PC, la interacción de las proteínas conectoras en las varillas de PC provocó un cambio significativo en la disposición del Disco B en la varilla de PC.

La superposición de la barra de PC resuelta por crio-EM y cristalografía de rayos X (código PDB: 3O2C; la estructura de PC de T. vulcanus) reveló que el cambio en la disposición de los monómeros de PC (monómeros 1–12) en la barra de PC fue causado principalmente por la interacción con las proteínas conectoras (Fig. 7 y Tabla complementaria 7). El RMSD entre los monómeros 1 en el Disco A (Fig. 7a) es pequeño (0,55 Å), mientras que entre los monómeros 3 es grande (2,60 Å) debido a la interacción entre las regiones CpcD (residuos 55–65 [rojo] y 68–74 [verde]) y regiones CpcB (residuos 109–122 [naranja]) en el monómero 3 (Fig. 7a). El RMSD entre el monómero 2 es el más grande en el Disco A (4,06 Å) (Fig. 7a), lo que sugiere que el cambio en la disposición del monómero 3 fue causado por el cambio en la disposición del monómero 2, que se requería para mantener la interacción. entre los monómeros 2 y 3. En el disco A (Fig. 7b), el RMSD entre el monómero 4, que se encuentra en el lado inferior del monómero 1, es tan pequeño como el de los monómeros 1 (0,76 Å) (Fig. 7b). Sin embargo, los RMSD entre los monómeros 5 y 6 son ligeramente mayores (1,49 Å y 1,40 Å, respectivamente), lo que sugiere que esto se debe a la interacción entre las regiones CpcC (residuos 123–127 [cian] y 197–204 [verde] ) y los de los monómeros 5 (residuos 14–17 [verde]) y 6 (residuos 113–122 [cian]).

un mapa crio-EM de la barra de PC (Disco A y Disco B). b Disposición de las proteínas conectoras (CpcC, CpcD y CpcG) en la barra de PC. c Estructura de la barra de PC en b girada 90˚.

a Superposición de las partes superiores del Disco A. La proteína enlazadora CpcD (residuos 55–65 [rojo en el "panel 1"] y 68–74 [verde en el "panel 1"]) interactúa con una región CpcB (residuos 109–122 [naranja en el "panel 1"]) en el monómero 3 de PC. b Superposición de las partes inferiores del disco A. La proteína enlazadora CpcC (residuos 123–127 [cian en el "panel 2"] y 197–204 [verde en el "panel 3"]) interactúa con las regiones CpcB (residuos 14–17 [verde en el "panel 2"] del monómero 5 de PC y 113–122 [cian en el "panel 3"] del monómero 6 de PC, respectivamente). c Superposición de las partes superiores del Disco B. La "estructura similar a CpcD (residuos 234–287)" en CpcC interactúa con una región CpcB (residuos 109–122, naranja en el "panel 4") en el monómero 9 de PC. El RMSD de las regiones (residuos 234–287) en CpcC y CpcD es 1,3. d Superposición de las partes inferiores del Disco B. La proteína enlazadora CpcG2 (residuos 9–38 [verde en el "panel 5"]) interactúa con regiones en los monómeros 10 (residuos 78–90 y 109–122 [amarillo en el "panel 5" ]) y 11 (residuos 1–15 y 105–115 [amarillo en el "panel 5"]). Las áreas marcadas "1–5" son la vista ampliada de las partes que interactúan de las proteínas conectoras y cada monómero de PC. Los modelos de hélice y de superficie transparente representan barras de PC resueltas por crio-EM y cristalografía de rayos X, respectivamente. Los paneles 1 a 6 muestran vistas ampliadas de las interacciones de cada trímero de PC con las proteínas conectoras.

En particular, la disposición de los monómeros en el Disco B se altera significativamente en relación con la de las varillas de PC resueltas por cristalografía de rayos X (Fig. 7c, d). Este importante reordenamiento también ocurrió en la barra de PC Nostoc 7120, lo que sugiere fuertemente que esto se debe a la interacción de las proteínas conectoras (CpcC y CpcG) en el disco B. Los RMSD entre los monómeros (7-12) en el disco B son 21,3 Å , 14,8 Å, 10,6 Å, 11,6 Å, 18,3 Å y 15,4 Å, respectivamente. El disco B (Fig. 7c) interactúa con CpcC y CpcG2, y la "estructura similar a CpcD (residuos 234–287)" en CpcC interactúa específicamente con la región CpcB (residuo 109–122 [naranja]) en el monómero 9, con esto la interacción es muy similar a la que existe entre CpcD y CpcB en el monómero 3. Para el Disco B (Fig. 7d), como en el Disco B (Fig. 7c), hubo un cambio significativo en la disposición en comparación con la estructura cristalina, es decir, interacciones entre residuos en la región CpcG2 (residuos 9–38 [verde]) y monómeros 10 (residuos 78–90, 109–122 [amarillo]) y 11 (residuos 1–15, 105–115 [amarillo]) (Fig. 7d ). Las proteínas enlazadoras contribuyen a la estabilización estructural de los bastones de PC, y muchas regiones de las proteínas enlazadoras están cerca de los cromóforos en los bastones, lo que sugiere que también contribuyen a ajustar los niveles de energía de estos cromóforos.

Además, superpusimos la varilla de PC T. vulcanus y la varilla de PC Nostoc 7120 (Rs1: varilla de PC que contiene CpcG2) para la comparación estructural (Fig. 16 complementaria y Tabla complementaria 7). Las estructuras generales son muy similares, con la disposición del Disco A y el Disco B en la barra de PC Nostoc 7120 diferente a la de la estructura cristalina. Esto sugiere que las interacciones simétricas entre el trímero PC en la estructura cristalina se deben al empaquetamiento del cristal. Una diferencia entre las dos varillas de PC es que la varilla de PC Nostoc 7120 (Rs1) no contiene CpcD, y la disposición del monómero de PC en la vecindad de CpcD en el disco A difiere de la de la varilla de PC Nostoc 7120 (RMSD = 2,79 ), lo que sugiere que este cambio en el arreglo fue causado por la interacción entre CpcD y CpcB en el monómero 3 de T. vulcanus.

La disposición de los cromóforos, especialmente en el límite entre los discos A y B en la barra de PC, difiere de la que se deduce del empaquetamiento de cristales de la estructura de PC debido a la interacción con las proteínas conectoras (Fig. 8). CpcD (LR), un pequeño dominio conector de capuchón de barra, es la proteína conectora más externa del PBS intacto, y la energía de excitación se transfiere del disco A al disco B en la barra de PC. Similar al núcleo de PBS, el acoplamiento excitónico entre los cromóforos contribuye a la transferencia de energía en las varillas de PC. Esta interacción da como resultado la transferencia de energía entre los monómeros de PC en el trímero de PC, de β155 a β84 y de α84 a β8452. Los β84 en el Disco A y el Disco B, que interactúan con CpcC, están muy cerca uno del otro en el hexámero de PC de la barra de PC, lo que sugiere que la energía de excitación se transfiere del Disco A al Disco B en la barra de PC a través de los cromóforos ( β84s) interactuando con CpcC (distancias entre cromóforos: 26–27 Å) (Fig. 8). En estudios espectroscópicos previos de PC, se propuso que β84 en una varilla de PC que interactúa con proteínas conectoras está involucrada en la transferencia de energía entre hexámeros de PC52,53,54. Por lo tanto, seis β84 (Fig. 8b) en el límite entre los discos A y B probablemente estén involucrados en la transferencia de energía entre los discos. Los residuos de aminoácidos característicos alrededor de los cromóforos en las proteínas conectoras y las interacciones entre estos residuos y los cromóforos probablemente sean cruciales para la transferencia de energía unidireccional en la barra de PC.

a Arreglo de cromóforos en la barra de PC. α84, β84 y β155 son de color cian, verde y amarillo, respectivamente. b Disposición de β84 en una barra de PC que interactúa con proteínas enlazadoras. Los β84 en el límite entre el Disco A y el Disco B son de color verde, y estos cromóforos están involucrados en la transferencia de energía entre el Disco A y el Disco B. Los residuos de aminoácidos de las proteínas conectoras cerca de los β84 se indican en B.

En resumen, el análisis crio-EM del núcleo de PBS y la barra de PC de T. vulcanus (una estructura hemidiscoide en muchas especies de cianobacterias) reveló la disposición de los cromóforos en el PBS y su estructura circundante. Identificamos tres trímeros APC en el cilindro A de T. vulcanus PBS, que diferían de los observados en PBS de otras especies de cianobacterias. La razón de esto sigue sin estar clara y, por lo tanto, se requieren investigaciones detalladas en el futuro. El cilindro C y sus estructuras circundantes en T. vulcanus PBS y la estructura general de ApcE, uno de los emisores terminales, eran muy similares a los de Nostoc 7120 PBS. En particular, la interacción entre el cromóforo en ApcE y Trp está altamente conservada, y esta interacción es crucial para la transferencia de energía de PBS a PSII. Sin embargo, los residuos de aminoácidos alrededor del cromóforo difieren ligeramente entre especies, lo que sugiere que esto refleja las diferencias en el ajuste fino del nivel de energía del cromóforo entre especies. La estructura general de las varillas de PC analizadas por cryo-EM es diferente de las estructuras de varillas de PC informadas anteriormente (particularmente la interacción entre los dos discos), que se considera que se debe a la interacción con las proteínas conectoras. Debido a que las varillas de PC se disocian fácilmente del núcleo de PBS, es difícil aclarar la estructura detallada. Por lo tanto, es necesario no solo analizar la estructura del PBS intacto, sino también analizar más las varillas de PC disociadas. Debido a que las estructuras de los PBS varían entre las especies, la información sobre las estructuras de los PBS proporciona una base para los estudios sobre la evolución de la fotosíntesis y la diversidad de sus vías. En el futuro, realizaremos estudios mutacionales, espectroscópicos y teóricos basados en esta información estructural, lo que ayudará a profundizar nuestra comprensión de la función de los PBS.

Se cultivaron células de la cianobacteria termófila T. vulcanus NIES-2134 en medio fosfatado55,56. Los PBS intactos y los núcleos de PBS se prepararon de acuerdo con los protocolos descritos por la ref. 26. Se prepararon membranas tilacoides, PSI y PSII de acuerdo con los protocolos descritos en las refs. 55,56. Para las varillas de PC, los PBS intactos se montaron en una rejilla de cobre recubierta con película de carbono perforada (consulte "Preparación de muestras y recopilación de datos para crio-EM" para obtener una descripción del pretratamiento de la rejilla), y luego una pequeña cantidad de tampón Se añadió rápidamente tampón de fosfato que contenía 10 mM para reducir la concentración de fosfato en la muestra a menos de 0,5 M. Esto dio como resultado la disociación de las varillas de PC de los PBS intactos.

Los PBS intactos se tiñeron con acetato de uranilo al 2 % (p/v) en una rejilla recubierta de carbono durante 1 min a 23 °C, y la solución que quedaba en la rejilla se eliminó antes del secado. Las rejillas resultantes se transfirieron a un microscopio electrónico (JM-2100; JEOL, Tokio, Japón) operado a 200 kV. Las imágenes se grabaron con una cámara Oneview (AMETEK, Berwyn, PA, EE. UU.) con un aumento nominal de 60 000 × (tamaño de píxel: 1,90 Å). El procesamiento de datos de las imágenes EM de tinción negativa se realizó con RELION-3.1.057. Los parámetros de la función de transferencia de contraste (CTF) se estimaron con CTFFIND4-1.1058 y las partículas de PBS intactas se seleccionaron con Xmipp359, un programa de selección de partículas sin referencia. En total, se seleccionaron 9358 partículas de 249 imágenes y se sometieron a la clasificación 2D sin referencia utilizando RELION-3.1.0.

Para aclarar la estructura del núcleo de PBS y la barra de PC, se prepararon rejillas para crio-EM de la siguiente manera. Una rejilla de cobre recubierta con una película de carbón perforada (Quantifoil R1.2/1.3 Cu 200 mesh; Microtools GmbH, Berlín, Alemania) que había sido pretratada con pulverización catódica de Au se descargó luminiscente durante 10 s usando un recubridor de iones (JEC-3000FC; JEOL , Tokio, Japón). Para el núcleo de PBS, se aplicaron 3,0 µL del núcleo de PBS a la rejilla y se secaron con papel de filtro durante 4 s, luego se congelaron inmediatamente en etano enfriado usando un FEI Vitrobot Mark IV (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) bajo 100% de humedad a 4 °C. Para la barra de PC, se aplicaron 3,5 µL de la muestra purificada a la rejilla y se diluyeron con 1,5 µL de tampón de fosfato 10 mM en la rejilla. Luego, la rejilla se secó y se sumergió manualmente en etano enfriado usando un émbolo casero. Luego, las rejillas se introdujeron en un microscopio electrónico CRYO ARM 300 (JEOL) equipado con una pistola de emisión de campo frío y un filtro de energía en columna con un ancho de rendija de 20 eV. Las imágenes fraccionadas por dosis se registraron utilizando un detector de electrones directo K2 cumbre (AMETEK, Berwyn, PA, EE. UU.) en modo de conteo. Todas las imágenes se corrigieron utilizando un sistema automático de adquisición de datos JEOL60 con un aumento nominal de 40.000x, que correspondía a un tamaño de píxel de 1,24 Å. Los rangos de desenfoque y las tasas de dosis nominales para el núcleo de PBS y la varilla de PC fueron de −0,5 µm a −1,5 µm y 84,1 e− Å−2 con 50 fotogramas y −0,5 µm a −1,5 µm y 50,5 e− Å−2 con 30 fotogramas, respectivamente . En total, recopilamos 4600 y 2865 películas para PBS core y PC rod, respectivamente.

Las pilas de películas recopiladas del núcleo PBS se dividieron en ocho grupos ópticos para corregir los cambios en la inclinación del haz a lo largo del tiempo. La corrección de deriva y la suma de cuadros ponderados por dosis se realizaron con MotionCor2-1.3.261, y los parámetros CTF se estimaron con CTFFIND4-1.1058. Las imágenes se seleccionaron para un mayor procesamiento de datos en función de los patrones de anillos de Thon. Las partículas del núcleo de PBS se seleccionaron manualmente y se sometieron a clasificación 2D sin referencia por RELION-3.1.057 para crear imágenes de referencia para la selección automática de partículas. En total, se seleccionaron y extrajeron automáticamente 128.676 partículas con un tamaño de píxel de 2,48 Å. Las buenas clases promediadas que contenían 45.427 partículas después de la clasificación 2D se sometieron a reconstrucción tridimensional (3D) ab initio en cryoSPARC-2.12.062. Siguiendo la clasificación 3D en RELION, se extrajo una clase 3D bien alineada que contenía 25 532 partículas con un tamaño de píxel de 1,24 Å y se usó para un mayor refinamiento 3D con aplicación de simetría doble. El posprocesamiento en RELION produjo un mapa de resolución de 4,75 Å basado en el estándar de oro FSC. Finalmente, la resolución alcanzó 3,71 Å después de dos rondas de pulido bayesiano y refinamiento CTF.

Para PC12mer, todas las pilas de películas se procesaron con MotionCor2-1.2.1 y Gctf-1.0663 para la corrección de deriva, la suma de fotogramas y la estimación de parámetros CTF. Las 812 327 partículas se seleccionaron mediante selección de redes neuronales convolucionales con EMAN-2.3.164 y se agruparon en un tamaño de píxel de 4,96 Å durante la extracción con RELION-3.0. Después de dos rondas de clasificación 2D, se seleccionaron 309 291 partículas y se sometieron a la construcción del modelo ab initio utilizando cisTEM-1.0.0 beta65. Las partículas buenas se recogieron automáticamente de nuevo con una referencia 3D utilizando el EMAN-2.3.1. En total, se seleccionaron 159 537 partículas con un tamaño de píxel de 1,86 Å de 1 022 349 partículas seleccionadas según las clasificaciones 2D y 3D. Se realizó el refinamiento 3D con RELION-3.0 y, después del pulido bayesiano, el refinamiento CTF y la clasificación 3D adicional mejoraron la resolución a 4,19 Å con 111 054 partículas sin aplicación de simetría. Para obtener más detalles, consulte las figuras complementarias. 4, 5 y Tabla Suplementaria 1.

Los modelos iniciales del núcleo de PBS y la barra de PC de T. vulcanus se construyeron utilizando modelos de referencia de PC y APC (códigos PDB: 3O18 y 3DBJ) y el modelado de homología se realizó en el servidor SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy. org/) haciendo referencia a las estructuras de las proteínas conectoras (códigos PDB: 5Y6P y 6KGX). Los modelos obtenidos se ajustaron con los mapas cryo-EM usando el programa "fit in map" en UCSF Chimera (versión 1.13), y se crearon los modelos iniciales del núcleo de PBS y la barra de PC. Los modelos iniciales se modificaron manualmente usando COOT para ajustarse al mapa crio-EM y se refinaron usando Phenix (versión 1.19.2). Posteriormente, cada subunidad y sus subunidades que interactúan en el núcleo de PBS y la barra de PC se agruparon y refinaron contra el mapa crio-EM usando REFMAC5 (versión 5.8.0267) en CCP-EM. Finalmente, los modelos agrupados se fusionaron en uno y las estructuras generales (núcleo de PBS y varilla de PC) se refinaron con Phenix. Las estadísticas de refinamiento de los modelos refinados se obtuvieron utilizando el programa de validación integral en Phenix. Las restricciones necesarias para los ligandos en el núcleo de PBS y la barra de PC de T. vulcanus fueron generadas por Ligand Bond Builder y Optimization Workbench66 electrónicos. La información de restricción para un Asn metilado (ID de ligando: MEN) y ficocianobilina (ID de ligando: CYC) se obtuvo del modelo de MEN identificado en una estructura cristalina de alta resolución (código PDB: 3O18). Se utilizaron la validación integral (en Phenix), Q-score39 y FSC-Q67 para validar los modelos estructurales refinados (núcleo de PBS y barra de PC).

Según la disposición de los PCB y su orientación en el núcleo de PBS construido, se estimó un factor de orientación aproximado, κ2 (Tabla complementaria 6). Estas estimaciones se realizaron especialmente para los sitios que probablemente estén involucrados en la transferencia de energía entre cilindros en el núcleo de PBS y para los emisores terminales. La tasa de transferencia de energía de excitación (kEET) viene dada por la ecuación. (1), donde V y Θ son el factor de acoplamiento electrónico y la integral de superposición, respectivamente.

Como se muestra en la figura complementaria 11 (a), el momento dipolar de transición del donante (D) y el aceptor (A) son μD y μA, respectivamente. r es la distancia intermolecular de centro a centro entre D y A. V se escribe mediante la ecuación de aproximación [Ecs. (2) y (3)], y el factor de orientación (κ2) se puede estimar mediante la ecuación. (4).

La orientación del momento dipolar de transición de los PCB se determinó refiriéndose a la ref. 68 (Figs. 11 y 12 complementarias).

Los espectros de absorción de la membrana tilacoide, PSII, PSII y PBS se midieron a 23 °C utilizando un espectrofotómetro UV-2600 (Shimadzu, Kioto, Japón). El espectro de la membrana tilacoide se midió utilizando el método de vidrio de ópalo.

Los polipéptidos desnaturalizados con ditiotreitol se separaron en un gel SuperSep que contenía 10-20 % de acrilamida (Wako, Tokio, Japón) y luego se tiñeron con azul de Coomassie (Fig. 2c complementaria). Se usó un sistema de imágenes de gel (sistema ChemiDoc XRS +; Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU.) para fotografiar los geles teñidos. Los polipéptidos separados (una banda que contiene ApcC y CpcD) se identificaron por MS. Las bandas de proteína obtenidas se trataron mediante digestión in situ utilizando tripsina69. Los péptidos fragmentados se analizaron mediante huellas dactilares de masa peptídica y MS/MS utilizando velocidad Autoflex (Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Alemania). Los espectros de masas obtenidos se analizaron utilizando el servidor MASCOT (Matrix Science Inc., Boston, MA, EE. UU.).

Treinta y ocho secuencias de ApcE de cepas seleccionadas de cianobacterias, glaucofitas y rodófitas se obtuvieron mediante el programa blastp en el sitio web del NCBI (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) (Figuras complementarias 8 y 9). Las secuencias se alinearon usando mafft (v.7.478) con la opción L-INS-i70. El árbol de máxima verosimilitud de las secuencias ApcE se estimó utilizando iqtree2 (v.2.1.4) con el modelo LG + F + R5 seleccionado por ModelFinder. El soporte estadístico de los árboles se estimó con 1.000 repeticiones de aproximación bootstrap ultrarrápida71. La organización del dominio de ApcE se determinó usando el programa hmmscan en HMMER (v.3.3.2; http://hmmer.org/) con la base de datos Pfam72. El árbol filogenético y la organización del dominio se visualizaron utilizando iToL (v.473).

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Las coordenadas atómicas y los mapas crio-EM para la estructura informada del núcleo de PBS y la varilla de PC de Thermosynechococcus vulcanus se depositaron en el Banco de datos de proteínas con los códigos de acceso 7VEA (núcleo de PBS) y 7VEB (varilla de PC), y en el Banco de datos de microscopía electrónica. bajo los códigos de acceso EMD-31944 (núcleo de PBS) y EMD-31945 (varilla de PC), respectivamente. Los gráficos y figuras generados en este estudio se proporcionan en el archivo de información complementaria/datos de origen. Otros datos están disponibles de los autores correspondientes a petición razonable. Los datos fuente se proporcionan en este documento.

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Agradecemos a los asistentes de investigación, la Sra. Yuko Kageyama (Laboratorio de mecanismos bioestructurales, Centro RIKEN SPring-8) y la Sra. Rie Uno (Universidad Metropolitana de Osaka) por su ayuda con los cultivos celulares, la preparación de muestras, el análisis de electroforesis y la espectroscopia. También agradecemos a la Sra. Tomomi Shimonaka de la Graduate School of Science, Osaka City University, por realizar la espectrometría MS/MS. Este trabajo fue apoyado por la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSPS) (JP20H05109 (a KK), JP20K06528 (a KK) y JP17H06434 (a NK)) y en parte por el Uso Conjunto/Investigación del Instituto de Nanomateriales Industriales, Universidad de Kumamoto. Número de subvención del programa JST-Mirai JPMJMI20G5 (a KY) y la Innovación cíclica para el empoderamiento clínico (CiCLE) de la Agencia japonesa para la investigación y el desarrollo médicos, AMED (a KK, TH y KY).

Estos autores contribuyeron por igual: Keisuke Kawakami, Tasuku Hamaguchi.

Laboratorio de mecanismos bioestructurales, Centro RIKEN SPring-8, 1-1-1, Sayo, Hyogo, 679-5148, Japón

Keisuke Kawakami, Tasuku Hamaguchi y Koji Yonekura

Instituto de investigación interdisciplinario inspirado en la electrónica, Universidad Tecnológica de Toyohashi, 1-1 Tempaku, Toyohashi, Aichi, 441-8580, Japón

Yuu Hirose

Instituto de Nanomateriales Industriales, Universidad de Kumamoto, Kumamoto, 860-8555, Japón

daisuke kosumi

Escuela de Posgrado en Ciencias, Universidad Metropolitana de Osaka, Osaka, 558-8585, Japón

makoto miyata

El Instituto de Investigación Avanzada de OCU para Ciencias Naturales y Tecnología (OCARINA), Universidad Metropolitana de Osaka, Osaka, 558-8585, Japón

Nobuo Kamiya

Unidad de desarrollo de microscopios electrónicos avanzados, Centro de colaboración RIKEN-JEOL, Programa RIKEN Baton Zone, Hyogo, 679-5148, Japón

koji yonekura

Instituto de Investigación Multidisciplinaria de Materiales Avanzados, Universidad de Tohoku, Miyagi, 980-8577, Japón

koji yonekura

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KK y NK diseñaron el estudio; KK preparó las muestras y realizó el análisis de electroforesis; KK realizó mediciones espectroscópicas, KK realizó la medición y el análisis del EM de tinción negativa; TH midió micrografías EM, y TH y KK procesaron los datos EM (núcleo PBS: TH; varilla PC: KK) y reconstruyeron el mapa EM final (núcleo PBS: TH; varilla PC: KK); KK realizó un análisis estructural; YH realizó un análisis de árbol filogenético; DK comentó sobre los análisis de datos; KY, NK y MM supervisaron el proyecto; KK, TH y KY escribieron el borrador del manuscrito; KK, TH y KY revisaron el manuscrito final; y todos los autores contribuyeron a la interpretación de los resultados y la mejora del manuscrito.

Correspondencia a Keisuke Kawakami o Koji Yonekura.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Noam Adir, Florent Waltz y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

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Kawakami, K., Hamaguchi, T., Hirose, Y. et al. Estructuras de núcleo y varilla de un ficobilisoma captador de luz de cianobacteria termófila. Nat Comun 13, 3389 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-30962-9

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Recibido: 28 de octubre de 2021

Aceptado: 24 de mayo de 2022

Publicado: 17 junio 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-30962-9

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